◆ 魚肉軟化と細胞外マトリックス分解 ◆

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 目次 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

 1.魚肉の軟化とは?  2.冷蔵中の筋肉構造の変化  3.体を支える細胞外マトリックス
 4.コラーゲン分解に関わる酵素  5.魚の組織中のコラーゲン分解活性  6.産卵期のアユでの活性発現
 7.刺し身の軟化に関わる酵素活性  8.軟化に関わる酵素遺伝子  9.TIMP (MMP阻害タンパク質)
10.死後でも生きている? 11.今後の課題 12.お礼

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9.TIMP (MMP阻害タンパク質)

■ TIMPはMMPの特異的阻害タンパク質である

   MMPが冷蔵中の魚肉軟化の原因の一つであることが推測されたことから、その活性を阻害する物質の性質を調べることにしました。組織内でのMMP活性はTIMP (Tissue Inihibitor of Metalloproteinase)という特異的阻害タンパク質により厳密に制御されています。これまでに哺乳類で4種類のTIMPが見つかっています。これらのTIMPの発現や分布、ターゲットとなるMMP等については次々と解明されてきていますが、魚のTIMPはサメの一種でTIMP-3が見つかっているだけです。冷蔵中の魚肉でのコラーゲン分解の亢進は、このTIMP活性が低下するために生じる可能性もあります。これを明らかにするためには、魚類コラーゲンのMMPによる分解の阻害様式を知る必要があります。そこで次に、MMPをクローニングしたヒラメからTIMPをクローニングすることにしました(Kubota et al., Biochim. Biophys. Acta, 1629/1-3, 102-108, 2003)。


■ PCRおよびRACEによるヒラメTIMP-2のクローニング

   数種類の哺乳類TIMP1,2および3の塩基配列を基に、多くのPCRプライマーを設計し、10種類の組織から調製したcDNAをテンプレートとして断片の増幅を試みましたが、哺乳類で知られている4種類のTIMPのうちTIMP-2の配列に類似した断片のみ増幅できました(右図A)。この断片の塩基配列を基にRACE法で全塩基配列を決定しました(右図B)。

右図 ヒラメTIMP-2遺伝子クローニングの概要:上段に示したアミノ酸配列に対応したプライマーを調製し、PCRを行った(A)。この塩基配列を基に再度プライマーを調製しPCRを行い全長を決定した(B)。Cは発現を調べるために行ったPCR用プライマーの場所。TIMP-2bについては後述


   一方、東京水産大学の青木先生・廣野先生のグループがヒラメ組織に発現するcDNAの塩基配列を片っ端から決定するEST解析を試みています。そのデータベースを調べることにより、ここでもTIMP-2遺伝子が見つかりました。面白いことに、PCR法で分離したヒラメTIMP-2とEST解析で見つかったそれは異なった塩基配列を持っていました。これまでに他の動物ではこれらTIMP-2が2種類あることは見つかっていないことから、魚類では2種のTIMP-2がそれぞれ異なった機能を持っており、哺乳類などとは異なった細胞が今トリックス代謝機構が存在するのかもしれません。

左図 ヒト、ニワトリTIMP-2とヒラメTIMP-2a (RACEによりクローニングした遺伝子)、TIMP-2b (EST解析で見出された遺伝子)のアミノ酸配列


   この両遺伝子がTIMP-2であるかの確認として、これまでに明らかにされている他のTIMPとともに分子系統樹を作成してみました(下図)。その結果、両TIMP-2はTIMP-4より後に分岐していることから、既知のTIMP-2と同じグループに属することが明らかとなりました。

下図 これまでにクローニングされたTIMPのアミノ酸配列を基にして作成した分子系統樹


   TIMP-2タンパク質は、構造上・機能上から2つのドメイン構造から形成されています。そこで、N末側、C末側それぞれの分子系統樹を作成したところ、N末側はTIMP-2aの方が既知のTIMP-2と近かったのに対し(右上図)、C末側はTIMP-2bの方が既知のTIMP-2に近い(右下図)という結果が得られました。この結果から、両ドメインは異なった機能を持ち、それぞれ硬骨魚類での進化が異なっていたと推測されました。

右図 ヒト、ニワトリ、ヒラメTIMPのN末端(上図)およびC末端(下図)ドメインのアミノ酸配列に基づいた分子系統樹




   両ヒラメTIMP-2が実際に発現しているのかどうかを知るため、ヒラメ組織から調製したcDNAを鋳型としたRT-PCR法でその遺伝子発現の分布を調べました。その結果、TIMP-2aとTIMP-2bのいずれもが、検討した全ての組織で発現していましたが、それぞれの組織間の発現レベルのパターンは明確に異なっていました。この結果は、両ヒラメTIMP-2はそれぞれ異なっているが生存に重要な機能を有することが推測されました。

下図 ヒラメTIMP-2aおよび2bの遺伝子発現の組織分布 A:RT−PCR法による遺伝子発現の組織分布、B:PCR産物のBamHI制限酵素処理(TIMP-2aにのみ切断サイトがあるので、それぞれ正しい断片が増幅されているかどうかの確認)、C:内部標準としてのb-Actinの発現(どの組織でもほぼ同じレベルでの発現が観察される)


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