■実験で使った試薬の組成

　　こちらから

　　タンパク質の分子量マーカーについてはこちら(製造元のHPにジャンプします）

■実験結果

皆さんの結果はこちら →→

■実験結果の解説
　
　

今回の実験では，V と N の 2 種類のサンプルがブロットされたメンブレンに対して免疫染色をしました。
メンブレンの V のレーンに，今回使った抗体の抗原であるホヤの Vasa タンパク質を発現するように遺伝子導入された
大腸菌から抽出したタンパク質がブロットされています。一方，N には，Vasa 遺伝子ではなく，Nanos 遺伝子を導入した
大腸菌から抽出したタンパク質がブロットされています。

　まずは，正解というかこうなるはずだったという結果を教えます。大腸菌が発現するミダレキクイタボヤのリコンビナント Vasa
タンパク質の質量は約 78 kDaです。大腸菌のタンパク質のなかから，リコンビナント Vasa タンパク質だけを精製して
電気泳動するとこうなります（Vasa タンパク質のSDS-PAGE)。つまり，今回の実験では 72 kDa のマーカーのちょっと上くらいに
バンドが出れば，予想通りということになります。皆さんの結果を見ると，，，うまくいってるようです。
　
　ポンソーS で染色したメンブンレン（左側で赤く染まっているほう）を見てみましょう。どの班も，マーカーから順に N → V です。
これを見ると、質量の異なるたくさんの種類のタンパク質がメンブレン上に転写されていることがわかります。また，ポンソーS 染色は
感度がそれほど良くないので，赤く染まっていない部分にも実際にはタンパク質があると考えられます。つまり，抗体を使うことで，
大腸菌から抽出したたくさんのタンパク質の中から Vasa タンパク質だけを見つけることができたわけです。

　N のレーンには抗原となる Vasa タンパク質がないはずなので，抗 Vasa 抗体を使って免疫染色しても，何も染まらないと予想できます。
こちらは予想通りなったでしょうか？

　ところで，この N のメンブレンは何のために作業したんだっけ？ なぜ，当たり前の結果が出ると分かっている実験をわざわざやったの
でしょうか？これは，科学の実験で大変重要な作業で，コントロール実験と呼びます。実験で使う抗体に対する抗原が含まれて
いない，とあらかじめ分かっているタンパク質に対して免疫染色をする。その結果，何も検出されないことが重要なのです。もしくは，
こんな場合は，どうでしょうか？N サンプルで 50 kDa の位置にバンドが検出されたとします。となれば，V サンプルにも同じように
50 kDa のバンドがでたとしても，このバンドは抗体が目的にタンパク質に結合したことで見えたバンドなのかどうか，疑わなければなりません。
同じ条件で、同時に作業したコントロール（ N サンプル）と V サンプルの結果を併せて示すことで，V のメンブレン上で 確かに Vasa タンパク質を
検出したと強く言えるわけです。

　簡単に言うと，V サンプルで見えたバンドから N サンプルで見えたバンドを差し引きして残ったバンドが，抗 Vasa 抗体がちゃんと
Vasa タンパク質に結合したことによって可視化された可能性が高いバンドと考えるわけです。

　V でも本命のバンドの下に，はしごの様に何本かのバンドが見えてきました。　なんででしょう？？　

　
　皆さんのレポートには，実験結果として見えた通りの結果を記述して下さい。
決して，「1本だけバンドが見えた」なんて嘘をついては駄目です。なぜ，複数のバンドがでたのか？はここでは，おいておきましょう。　
なぜなら，ウェスタンブロットに関する下の「課題」を考えることで，答えがいくつか見つかってくるように思うからです。課題に取り組んだ後，
もう一度自分たちの結果を見直してみてさい。

●課題●（問題は 1 つ)

�@ 皆さんが実験に使った「抗ホヤVasaタンパク質モノクローナル抗体」は，細胞分子工学研究室と高知大動物実験施設（岡豊キャンパス）で
　作製されたもので，実際に研究で使われています。2008年，学術論文のなかでをこの抗 Vasa 抗体ができたことを報告しました。論文では，
　下のようなウエスタンブロットの結果を載せました。　論文の実験では大腸菌ではなくミダレキクイタボヤからタンパク質を抽出し，Vasa
　タンパク質を検出しました。ミダレキクイタボヤの Vasa タンパク質については Vasa 遺伝子の塩基配列をもとにアミノ酸配列が分かっており，
　そこからタンパク質の分子量を予測することができます。予測された分子量は 74 kDa だったので，作製した抗体は，きちんとミダレキクイタボヤの
　生体に存在する Vasa タンパク質に結合する（写真の矢尻のところのバンド）と報告しました。

　ところが！，論文の審査員から　「42 kDa くらいにバンド（＊印）が見える！これが何なのかちゃんと説明しなさい」という指示が来ました。
　ということで，課題は，この 42kDa くらいにバンドがでた理由を考えて下さい。

　←論文に載せた写真

★注意点
　この課題には，決まった1つの答えがあるわけではありません。それぞれ結果の写真にたどり着くまでの実験過程，
（タンパク質の精製方法や抗体が出来る仕組み，モノクローナル抗体の作り方，ウェスタンブロッティング　etc..）を考えて，
どこでどんなことがおこった結果，そこに（42 kDa の）バンドがでたのか？ありとあらゆる可能性を考えてみてください。
重要なのは，きちんと論理が通っていることです。また，「何かの手違いがあった　とか　実験が下手くそだから」というような
一言で済ますのもだめです。よーーーく 考えて，書いてください。

　疑問がある人は遠慮なく砂長まで相談してください。無論，答えは教えませんけどね。
　再度，書きますが，答えが1つ決まっているわけではありません。

はじめにもどる　→→