● total RNA の抽出/クオリティチェック

　実験の方法は，Chomczynski & Sacchi (1987) が発表した AGPC 法（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction 法）
を原理とした方法を用いる。ただし，詳細については，使用した市販試薬（RNA iso+ TAKARA社）の説明書に従っている。
　AGPC 法では、強力なタンパク質変性剤を含む水溶液中で細胞を溶かし，フェノール/クロロホルム抽出によってタンパク質を沈殿させる。
そのとき，溶液を酸性にしておくことで，DNA がフェノール/クロロホルム層（下層）に行き， RNA が水層（上層）に溶け込むことを利用して，
RNA を抽出・精製する。RNA iso+は，細胞の溶解とフェノール/クロロホルム抽出が 1 ステップで作業できるように調合された試薬と予測できる。

★ 結果 ★

-アガロースゲル電気泳動
　　各グループから預かった total RNA 水溶液（10 uL）のうち，2 uLをアガロースゲルで電気泳動した。M のレーンで泳動したマーカーは，
二重鎖 DNA のマーカーであるため，RNA の鎖長を判定する物差しとしては使えないので注意すること。
　　ただし，光の強さ（白くみえる部分）はそこにある核酸の量を反映していると考えてよい。強い光，太いバンドはそれだけ核酸の量が多い。

　　

-吸光度測定による定量および純度測定
　　測定のために超純水で希釈したが，器械に表示された数値は，原液に対する値である。

		4細胞期	胞胚期	初期プルテウス幼生
1 班	濃度 (ug/uL)	0.190	1.679	0.777
1 班	A260/A280	1.76	1.93	1.90
2 班	濃度 (ug/uL)	0.096	0.580	0.121
2 班	A260/A280	1.76	1.80	1.81
3 班	濃度 (ug/uL)	0.069	0.386	0.128
3 班	A260/A280	1.72	1.75	1.72
4 班	濃度 (ug/uL)	0.134	0.184	0.320
4 班	A260/A280	1.71	1.70	1.81
5 班	濃度 (ug/uL)	1.153	0.449	0.701
5 班	A260/A280	1.80	1.62	1.70
6 班	濃度 (ug/uL)	0.153	0.170	0.256
6 班	A260/A280	1.62	1.56	1.65

★ レポート作成のポイント

　　実験結果の説明として，上記の電気泳動写真および数値を使用し，抽出した RNA のクオリティチェックを自分たちでしてください。
　自分たちの班の結果を中心に述べるのが基本ですが，他班の結果も材料にして，濃度と電気泳動像のつじつまが合っている
　かどうかなど，考察してみてください。A260/A280 とは何なのか調べてみると深い考察ができるかもしれません。

★ 課題１
　　RNA をゲル電気泳動で分離する正しい方法について，説明してください。ただし，「○×○×法」のように単語で答えるのではなく，
　RNA の性質などについても触れながら，手順や使われる試薬などが「何ための手順なのか？」「その試薬にどんな効果があるのか？」
　が分かるように記述してください。

　※今回の実習でやったアガロースゲル電気泳動は，決しておかしな電気泳動をしたわけではありませんが，RNA を正しく鎖長ごとに
　分離できる方法ではありません。RNA 抽出の成否を簡易に判定したいときにやります。なので，この課題で，「正しい方法」を自学で
　理解してもらいます。

● total RNA の抽出/クオリティチェックのつづき
　　なお，今回の実習では，全ての班（６つ）のRNAを混合し，スタッフに手によって。改めて，RNA を精製した。この「精製」は「抽出」という
　意味ではなく，「キレイにした（clean-up）」という意味である。　精製後の RNA の電気泳動像と吸光度測定結果は以下の通り。

		4細胞期	胞胚期	初期プルテウス幼生
total RNA	濃度 (ug/uL)	0.017	0.310	0.130
total RNA	A260/A280	----	1.84	1.90

※この結果を受けて，4細胞期から抽出した RNA に対する作業をここで諦めて，胞胚と初期プルテウス幼生から抽出した
　RNA を使って，続きの作業をすることにした。

　2）　逆転写反応による cDNA 合成へ

　3）　RT-PCRへ

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