海洋生命・分子工学実験 II
(5) PCR によるプラスミドクローンのチェック
（コロニー PCR 法）
はじ
めに
トランスフォーメーションの後一晩培養すると，プレートにはたくさんのコロニーができるはずです
（できてほしいなあ）。一つ一つのコロニーは，基本的に単一のプラスミド（ライゲーション反応の
結果生じた環状プラスミド 1 分子）が入った大腸菌の細胞 1 個に由来する “クローン” です。
この後は，大腸菌を試験管で増殖させた後にプラスミドを miniprep で精製し，塩基配列を確認
したいし，試験管で培養した大腸菌に mCherry タンパクを作らせたりしたいですね・・・。でも，
プレート上にたくさんできたコロニーの全てが，正しく mCherry を組み込んだ pBluescript II SK+
を持っているとは限りません。ここまでの実験の作業にちょっとした不手際があれば・・・
* もしかして pBluescript II SK+ ベクターに EGFP が残っているかも知れません。
* EGFP を切り捨てた後の pBluescript II SK+ ベクターが，何も挿入せずに環を閉じてしまった
かも知れません。
* あるいは pCR II-mCherry が入ったコロニーが増えてきたり・・・なんて可能性もあります。
今回の実習では，コロニーが赤ければまず問題はありません。しかし，期待した通りのプラスミド
が組み立てられていない可能性があると考えたら，いきなり試験管で培養するよりも，その前に
チェックしておいた方がよさそうです。実際，試験管で培養してプラスミドを精製するのには
結構手間がいりますから。
ここでは，PCR
法を利用して簡単にチェックしてみましょう。この方法は，コロニー PCR 法と
いいます。
知っておかなければな
らないこと
PCR は「専門海洋生命・分子工学基礎実験」で
やっていると思いますので説明しません。原理
のわからない人は，2002 年以前のこの実験の web テキストで勉強しておいてください。あるいは
下記の参考書を読んでみてください。
「PCR 実験マニュアル」
M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White 著，斉藤隆監訳 HBJ出版局
「生物学 -分子が語る生命のからくり-」
松岡達臣・松島治編著 朝倉書店 第 2 章を参照。
「バイオ実験イラストレイテッド 3. 本当にふえる PCR」
中山広樹著 秀潤社 細胞工学別冊
「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」
Sambrook, J. & Russell, D. W. 著 Cold Spring Harbor Laboratory
Press
料理本のようなものですから英語は簡単です。原理などを詳しく解説してあるのでお薦め。
分子生物学研究者のバイブルと言われています。
「ラボマニュアル遺伝子工学・増補版」
村松正實編 丸善
この実習では，下記の二つのプライマーを用いて PCR を行います。
T3： 5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3'
mCherry-R： 5'-CTTGATCTCGCCCTTCAG-3'
さて，ここでまたまた問題です！
【 予習問題 】 上述のプライマーについて下記の問いに答えてください。
（1） T3 プライマーは，pBluescript II SK+ の配列にアニーリング （annealing） します。
その配列は （0） プラスミドの塩基配列の確認 の図 6 を見ればわかります。
探してください。
（2） mCherry-R プライマーは，mCherry cDNA の配列にアニーリングします。
その配列も （0） プラスミドの塩基配列の確認 の図 3 を見ればわかります。 〔 難 〕
ただ探しても見つかりません。ヒントをいくつかあげます。
（a） PCR をするんだということを忘れないように （このヒントだけでわかったらエライ）
（b） PCR をするときって，プライマーの向きはどうなっていなければいけないんだった？
（c） pBluescript II SK+ に mCherry cDNA が正しく組み込まれたとしたら，図 6 の
配列と図 3 の配列は，どういう方向に連結するんだったかな？
（d） 「mCherry-R」 という名前の 「-R」 ってどういう意味で付けられたのかなぁ？
・・・これらのヒントを読んでもわからないようなら，藤原のところへ質問に来ること。
（3） プラスミドが正しく期待通りに組み立てられていた場合， T3 と mCherry-R で増幅
される PCR 産物の長さは何塩基対ですか？ およその数字で計算してください。
（4） 「はじめに」 欄に書いたような失敗のケースではどういう結果になるでしょうか？
さて，上の問題をよく考えたうえで， PCR 産物をアガロースゲル電気泳動によって
チェックしてみましょう。
実験
1．
1.5 mL チューブに滅菌水を 10 μL 入れる。2．
大腸菌のコロニーを爪楊枝で拾って，1.5 mL チューブの滅菌水の中に入れる。 注： 火のそばで行う。この実習では， 1 人 1 個。
3．
0.5 mL チューブに 2x PCR
の反応液を作る。
以下の試薬を混ぜて氷冷しておきます。1 人分の 2x 反応液は 5 μL としますので，
下の表の反応液は 10 人分です。これを 8〜9 人で使います。
注： PCR 法は，ごく微量の鋳型を多量に(数十万倍から数百万倍に）増幅する手法
なので細心の注意が必要です。わずかに混入した自分の細胞（指先などから）の
DNA が鋳型となって，自分の遺伝子の断片が増幅されるかも知れません。フタを
開けるときにフタの内側に触らないように。マイクロピペットのチップを素手で
触ったり，チップの先を机やノートにつけたりしないように注意しましょう。
4．
1 人 1 本の，新しい 0.2 mL チューブを用意して，5 μL の 2x 反応液を入れる。
注： このあと，この反応液に対して，生きたままの大腸菌の懸濁液を加えるので，
この段階でみんなが揃うのを待ちます。全員の準備ができたら次のステップへ。
5．
各自の大腸菌懸濁液を 5 μL とって，2x 反応液に加え，そのピペットで混ぜる。
注： 大腸菌の懸濁液が 5 μL 残りますね。これを捨てずに回収します。
* この懸濁液に培養液を少量加えて PCR の間 37℃ に置いておけば，
PCR の結果がわかる頃 （数時間後） には少し培養液が濁るくらいに
大腸菌が増殖します。その半分 （あるいは全量） を試験管に移せば
さらにその数時間後には miniprep ができるほどにまで菌が増殖します。
これによって実験が大幅にスピードアップして時間を節約できます。
* さらに，懸濁液に爪楊枝の先を浸け，それを新しい寒天培地に植えれば
みんなが初日に使ったような，保存用の菌 （マスタープレート） ができる
のです。
6．
サーマルサイクラーにチューブをセットして PCR 反応開始。
温度条件(プログラム）は以下のとおり。
（1） 95℃ で 2 分
（2） [ 94℃ で 30 秒，50℃ で 30 秒，72℃ で 1 分 ]
を 30 回繰り返す。
（3） 25℃ で保温。
実習の時間中に結果を見たいので，少し短めの反応時間です。そのために，
mCherry cDNA 中にプライマーを作りました。
5．
PCR 反応液の全量 10 μL に対して，6 x
色素溶液を 2 μL 加え，6 μL を
電気泳動する。
実験
に使う試薬
(a) 10x PCR バッファー
メーカーによっていろいろだが，今回使う 10x バッファーの組成は
[100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，500 mM KCl，15 mM MgCl2，0.01% ゼラチン]
(b) dNTP mixture
各 2.5 mM の dATP，dCTP，dGTP，dTTP の混合液。
(c) Taq DNA polymerase
Thermus aquaticus という好熱性細菌からとられた
DNA 依存性 DNA ポリメラーゼ。PCR に
用いられる酵素の中で最もポピュラーであるが，proof-reading 機能が弱く，ときどき間違った
ヌクレオチドを取り込むことが知られている。また，合成した鎖の 3' 末端に，鋳型と無関係な
アデニンヌクレオチドを 1 個付加するクセがあり，これを利用して効率よくプラスミドに組み
込む手法も開発されている。詳しい情報については「知っておかなければならないこと」の中で
紹介した本を読むこと。今回の実習で使うのは Ampliqon 社製。
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