total RNA の抽出/クオリティチェック

 実験の方法は,Chomczynski & Sacchi (1987) が発表した AGPC 法(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction 法)
を原理とした方法を用いる。ただし,詳細については,使用した市販試薬(RNA iso+ TAKARA社)の説明書に従っている。
 AGPC 法では、強力なタンパク質変性剤を含む水溶液中で細胞を溶かし,フェノール/クロロホルム抽出によってタンパク質を沈殿させる。
そのとき,溶液を酸性にしておくことで,DNA がフェノール/クロロホルム層(下層)に行き, RNA が水層(上層)に溶け込むことを利用して,
RNA を抽出・精製する。RNA iso+ は,細胞の溶解とフェノール/クロロホルム抽出が 1 ステップで作業できるように調合された試薬と予測できる。


★ 結果 ★

-吸光度測定による定量および純度測定
  測定のために超純水で希釈しましたので,表示の数値は希釈後の RNA の濃度です。

  以下の値は,機器(バイオフォトメータ)に表示された値である。

. . 値 1 回目 希釈 発生段階 電気泳動量
1 班 濃度 (ng/uL) 63 1/10. 16 細胞期
(16)
1000 ng 計算.
(1 ug) .
A260/A280 2.06 .
2 班 濃度 (ng/uL) 76 1/10.
A260/A280 2.12 .
3 班 濃度 (ng/uL) 73 1/10. 胞胚期
(B)
A260/A280 1.86 .
4 班 濃度 (ng/uL) 54 1/10.
A260/A280 1.74 .
5 班 濃度 (ng/uL) 67 1/5. 原腸胚期
(G)
A260/A280 2.06 .
6 班 濃度 (ng/uL) 15 1/5. プルテウス幼生
(P)
200 ng 計算.
(0.2 ug) .
A260/A280 1.97 .
. 濃度 (ng/uL) . . .
A260/A280 . .
. 濃度 (ng/uL) . .
A260/A280 . .
. . . . . .

-アガロースゲル電気泳動
  各グループの total RNA 水溶液をアガロースゲルで電気泳動した。M のレーンで泳動したマーカーは,二重鎖 DNA のマーカーであるため,
 RNA の鎖長を判定する物差しとしては使えないので注意すること。
  ただし,光の強さ(白くみえる部分)はそこにある核酸の量を反映していると考えてよい。強い光,太いバンドはそれだけ核酸の量が多い。



※ 1,4,5,6 班の RNA から作製した cDNA を RT-PCR の鋳型として使用した


★ レポート作成のポイント

  
実験結果の説明として,上記の吸光度計での測定値と電気泳動写真を使用し,抽出した RNA のクオリティチェック (QC)を自分たちで
 やってみてください。
  自分たちの班の RNA の品質を中心に述べるのが基本ですが,他班の結果も材料にして,濃度と電気泳動像のつじつまが合っているか
 どうかなど,考察してみてください。A260/A280 とは何なのか?調べてみると一段深い考察ができるかもしれません。


★ 課題1
  今回の実習でやったアガロースゲル電気泳動では,TAE バッファーにアガロース(1% w/v)を溶かして,型に流し込み,冷やして固めたゲルを使い,
 TAEバッファー中で電気泳動しました。しかし,この方法では,RNA を正しく鎖長ごとに分離することができません
  
  そこで,この課題では,,「正しい方法」を自学で理解してもらいます。RNA をゲル電気泳動で分離する正しい方法について,説明してください。
 ただし,「○×○×法」のように単語で答えるのではなく,RNA の性質などについても触れながら,手順や使われる試薬などが
 「何ための手順なのか?」「その試薬にどんな効果があるのか?」が分かるように,でもなるべく簡潔に記述してください。





 2) 逆転写反応による cDNA 合成へ

 3) RT-PCRへ



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