2‐X. （おまけ）予備実験の結果
はじめに
このページでは、2-1 から 2-11
までの実験を実際にやってみた結果をお見せします。
それは、皆さんが実際に作業をする際に、具体的なイメージを持てるように、と
考えてのことです。
このページはレポートの見本ではありません。
ここでは、ただデータを見せるだけで、結果の解釈や考察はなるべくしないようにします。
議論や考察は、皆さん、自分自身でじっくり考えてレポートにしてください。
RNA 抽出
2-1 で抽出した RNA （100
μl の DEPC処理水に溶かしてある）のうち、 10 μl を
1% アガロースゲルで電気泳動した結果です（図1）。
図1
PCR
抽出した RNA からの逆転写によって合成した cDNAを鋳型にして、2‐3 の方法で
カリガネエガイのヘモグロビン（BvII） cDNA を増幅した結果です。 PCR 反応液
50 μl のうちの 10 μl を泳動しました（図2）。左のレーンが φX174／HaeIII マーカー。
右のレーンが PCR 産物です。
図2 
PCR 産物の制限酵素切断片のアガロースゲルからの精製
PCR 産物とプラスミド（pQE-30）をそれぞれ 2-4 のプロトコルどおりに制限酵素で
切断して電気泳動した結果が 図3 です。ゲルから各 DNA 断片を精製し、20 μl の
TE に溶かした後、5 μl 分を電気泳動した結果が 図4 です。プラスミド断片の精製は
2-5 のプロトコルどおりに
Easy Trap で行いましたが、ヘモグロビン cDNA は
ズルをして、別のキット（QIAEX II）で精製しました。
図3 は左から PCR 産物、プラスミド、φX174／HaeIII マーカーです。
図4 は左から φX174／HaeIII マーカー、PCR 産物、プラスミドです。
図3 
図４ 
トランスフォーメーション後のプラスミドクローンの制限酵素チェック
2‐6
で PCR 産物と pQE‐30 プラスミドを連結し、それを大腸菌に導入しました。
2-7 では大腸菌のコロニーを拾って培養し、プラスミドを抽出・精製しました。
そして、2-8 でそのプラスミドを制限酵素で切断し、正しく
PCR 産物が
組み込まれているかどうかをチェックしました。ここに示すのは、その制限酵素
チェックの結果です。大腸菌のコロニーは 2 個拾いました。
2-8 では、HindIII
で切るというチェックだけをしましたが、ここでは、 BamHI と
SalI で同時切断した結果も示します（図5）。
図5 では 5 レーンあるうちの真ん中が φX174／HaeIII マーカーです。
左の 2 レーンは HindIII で切ったものを泳動しました。左からクローン #1、#2 と
しましょう。右の 2 レーンは同じクローン #1、#2 を BamHI と SalI で同時切断
して泳動しました
「あれ？」と思いましたか？
2‐8 のページで、XhoI
と SalI で切った切断末端をつないだので、その箇所は
もう XhoI でも SalI でも切れなくなると言いましたね。でも、実は（黙ってましたが）
今回の実験で作ったプラスミドは、正しくできあがったものを、SalI で切ることが
できるのです。なぜでしょうか？（ヒントはあっちこっちにありますが、一番わかり
やすいのは 2-4
の｢知っておかなければならないこと」の部分だと思います。
そこのセクションを”穴のあくほど”読んでみましょう。）
図5 
クローン #1 と #2 では、BamHI と SalI で同時切断したときのパターンが違いますねぇ。
気づきましたか？
リコンビナントタンパクの発現
2‐10 の方法にしたがって、拾った大腸菌クローンのうちいくつかを培養し、
IPTG でリコンビナントタンパクの発現を誘導した後、大腸菌全タンパク質を抽出して
SDS-PAGE を行いました（図6）。
図では、左から、3クローン分のタンパクを泳動しています。上の 図5 で見たクローン
#1 と #2 はそれぞれ左から 2 レーンめと 3 レーンめです。一番左のレーンに流した
タンパクは、それらとは別のクローンのものです。右端は分子量マーカーで、
バンドのサイズは上から、94、67、43、30、20.1、14.4 （単位は kDa）です。
図6 
リコンビナントタンパクの精製
2-11
の方法にしたがってリコンビナントタンパクを精製し、SDS-PAGE を行いました。
図7 はその結果で、レーンは左から、以下のとおり。
（1） 分子量マーカー（図6 と同じもの）。
（2) 大腸菌を超音波で破砕してタンパクを溶出させ、遠心でくずを除去した後の粗抽出物。
（3） バッファー B 中で His-タグ付きリコンビナントタンパクを Ni2+-NTA ビーズに吸着させ、
ビーズを沈殿させた後にとった上清。
（4） 1 回めの洗浄液（バッファー C）
（5） 2 回めの洗浄液（バッファー C）
（6） バッファー E' を加え、ビーズから上清中に再び溶かし出したタンパク。
図7 
どう？ イメージはわいた？