[ アルギニンキナーゼの抽出 ]

（１）冷凍エビ約（7 g）に ４℃ に冷やした 20 倍量の buffer: 10 mM Tris-acetate
　　　buffer (pH 8) containing 0.1 mM DTT，140 ml を加え，ホモジナイズする．
　　　Buffer の作製法は？

（２）ホモジネートを遠心管に入れ，バランスを十分調節した後，4℃，10000 rpm，
　　　10 分間遠心する．

（３）遠心終了後直ちに遠心管を取り出し，各班上清の 1 ml をエッペンドルフ
　　　チューブに分取する．チューブは氷冷する．残りの上清をガーゼでろ過し氷冷
　　　したメスシリンダーに移す．容量を測定する．その後氷冷したビーカーに移し，
　　　50％飽和になるように硫安をガラス棒でかきまぜながら徐々に加える．硫安が
　　　完全にとけたのを確認したら，4℃，10000 rpm，10 分間遠心する．

（４）遠心終了後直ちに遠心管を取り出し，ガーゼでろ過した上清を氷冷したメス
　　　シリンダーに移し，容量を測定する．その後氷冷したビーカーに移し，80％ 飽和
　　　になるように硫安をガラス棒でかきまぜながら徐々に加える．硫安が完全にとけた
　　　のを確認したら，4℃，10000 rpm，15 分間遠心する．

（５）沈澱に目的タンパク質が含まれているので，上清を注意深く，完全にすてる．

（６）沈澱を氷冷した 5 ml の 10 mM Tris-acetate buffer (pH 8) containing
　　　0.1 mM DTT に溶かす．

（７）各班 ２ 本のエッペンドルフチューブに 1.0 ml ずつ分取し，4℃，
　　　12000 rpm，10 分間遠心する．遠心終了後，直ちに上清を新しいエッペン
　　　ドルフチューブに移す（沈澱物を決して取らないように）．
　　　チューブは氷冷して保存する．

[ ゲル濾過によるアルギニンキナーゼの部分精製 ]　

（８）高速液クロにセットしたゲル濾過カラム（Superose 12 or Superdex 75:
　　　1 x 30 cm)を 10 mM Tris-acetate buffer (pH 8) containing 0.1 mM DTT
　　　& 50 mM NaClで十分に平衡化する．（流速は 0.5 ml/min；タンパク質の
　　　存在は波長280nmで検出）．

（９）前項の（７）で得たサンプルの 250 ml をカラムにアプライする．

（10）モニターを見ながら，タンパク質が溶出してきたら 1.5 ml チューブに分取する．
　　　複数のピークが溶出されるのでピークごとに分取すること．1 ml 以上は同じ
　　　チューブに分取しないこと．タンパク質を分取したチューブは直ちに氷中に
　　　保存する．

[ SDS 電気泳動 ]

（11）前項の（３），（７）及び（10）の各チューブの 50 ml を，新しいエッペンドルフ
　　　チューブに取り，50 ml の SDS 電気泳動用サンプル buffer と10 ml の
　　　2-メルカプトエタノールを加える．それらを 3 分間加熱 （98℃）する．

（12）SDS 電気泳動用ゲルは空き時間に作製しておく（作製方法は別途指示する）．
　　　電気泳動装置をセットし，処理したサンプルをアプライする（アプライ量は 5 ml
　　　と 25 ml の 2 種類おこなう）．分子量のマーカーもアプライする．

（13）電気泳動終了後，染色及び脱色をおこない，アルギニンキナーゼ（分子量 40
　　　kDa）の含まれるフラクションを同定する．泳動時間は 90 分程度，染色・脱色
　　　時間に 60 分程度を要する．

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