[ 酵素反応 ]

        アルギニンキナーゼの含まれるフラクション（氷中保存）を用いて酵素活性を
測定する．先ず酵素の濃度を概算するために，タンパク質溶液を注意深く 280 nm
でその吸光度を測定せよ．280 nm の吸光度が 0.77 のときにタンパク質濃度が
1.0 mg/ml であるとして，酵素濃度を求めよ．基質（アルギニン）濃度を変えることに
よって，酵素反応の Km と Vmax 値を求める．酵素活性は以下の原理（解糖系で
起こる反応）によって測定する．最終的に NADH が NAD+ に変化するとき 340 nm
の吸光度が大きく変化することを利用し，その変化率（Δ340/min）を分光光度計で
追跡することで酵素活性を測定する．
 
 

（１）反応混液の作成

0.65 ml 100 mM Tris/HCl (pH 8)
0.05 ml 750 mM
0.05 ml 250 mM
0.05 ml 100 mM ATP (made up in 100 mM imidazole/HCl [pH 7])
0.05 ml 25 mM Phosphoenolpyrvate PEP (made up in
　　　　　100 mM imidazole/HCl [pH 7])
0.05 ml 5 mM NADH (made up in above Tris buffer)
0.05 ml LDH/PK mixture ( 20 ml Lactatedehydrogenase + 50 ml
　　　　　pyruvate kinase + 430 ml 100 mM imidazole/HCl [pH 7])
 

上記の試薬を正確に 1.5 ml チューブ中で混合し(total 0.95 ml)，25℃ で
２ 分間加温する．その後直ちに 1 ml セルに移す．分光光度計のセル室は
25℃ にあらかじめセットしておく．

（２）酵素反応開始前の準備

340 nm の吸光度を 1 分間追跡せよ． (PEP is comtaminated with pyruvate
and ATP contains a small amount of ADP).

Add a small amount of arginine kinase (10 -100 microliters depending on
activity: use 50 ml in this experiment) and record absorbance at 340 nm
for 1 min (if your enzyme sample is contaminated with  ATPase you will
get a slow decrease in absorbance).

（３）酵素活性の測定

Add 0.05 ml of 200 mM arginine and record absorbance vs. time
for 2-5 min.

（４）反応速度の算出

AK [ΔA340/min]
        = ΔA340/min (after arginine addition) -  ΔA340/min (before arginine)
 

AK activity [micromoles/min]
        = AK[ ΔA340/min] divided by 6.22 multiplied times total volume of
             assay mixture in ml (should be 1.01 - 1.03)

AK activity を酵素 1 mg あたりに換算せよ[micromoles/min/mg protein]．

（５）KmとVmax値の算出

200 mM 基質アルギニン溶液を薄めて，5 mM，10 mM，50 mM のものを
作製せよ．各濃度のアルギニンを用いて，上記の手順で酵素反応を
おこない AK activity を求める．ただし（2）の 340 nm の追跡は行わなくて
良い．基質濃度を変化させたときに，速度にあまり変化が見られない場合
には酵素濃度を適宜変化させよ．
基質アルギニンの反応液中の最終濃度(mM)の逆数に対して，酵素 1 mg
当たりの AK activity の逆数をプロットせよ．この結果から Km と Vmax 値
を求めよ．Km と Vmax は酵素反応においてどのような意味を持つのか？

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