PCR によるプラスミドクローンのチェック

「PCR 実験マニュアル」
　M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White 著，斉藤隆監訳　HBJ出版局
「生物学 -分子が語る生命のからくり-」
　松岡達臣・松島治編著　朝倉書店　　第 2 章を参照。
「バイオ実験イラストレイテッド　3. 本当にふえる PCR」
　中山広樹著　秀潤社　細胞工学別冊
「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」
　Sambrook, J. & Russell, D. W. 著　Cold Spring Harbor Laboratory Press
　料理本のようなものですから英語は簡単です。原理などを詳しく解説してあるのでお薦め。
　分子生物学研究者のバイブルと言われています。
「ラボマニュアル遺伝子工学・増補版」
　村松正實編　丸善

1．　PCR の反応液（premix）を作る。
　　　Miniprep で精製した DNA の RNaseA 処理の待ち時間に，以下の試薬を混ぜて
　　　氷冷しておきます。1 人の反応液を 20 μL としますので，下の表の反応液は
　　　10 人分です。これを 8 人で使います。

滅菌水	133 μL
10x PCR バッファー ^(a)	20 μL
dNTP mixture ^(b)	16 μL
10 pmol/μL QE-Xho プライマー ^(c)	10 μL
10 pmol/μL QE-C プライマー ^(c)	10 μL
5 units/μL Taq DNA ポリメラーゼ ^(d)	1 μL

　　　注：　PCR 法は，ごく微量の鋳型を多量に(数十万倍から数百万倍に）増幅する手法
　　　　　　なので細心の注意が必要です。わずかに混入した自分の細胞（指先などから）の
　　　　　　DNA が鋳型となって，自分の遺伝子の断片が増幅されるかも知れません。フタを
　　　　　　開けるときにフタの内側に触らないように。マイクロピペットのチップを素手で
　　　　　　触ったり，チップの先を机やノートにつけたりしないように注意しましょう。

2．　Miniprep で精製したプラスミドを 1 μL とって滅菌水 100 μL で希釈する。

3．　新しい 0.5 mL チューブに，反応液（premix）を 19 μL と，希釈したプラスミド
　　　水溶液 1 μL を入れて混ぜる。

4．　サーマルサイクラーにチューブをセットして PCR 反応開始。
　　　温度条件(プログラム）は以下のとおり。
　　　（1）　95℃ で 2 分
　　　（2）　[ 94℃ で 30 秒，50℃ で 1 分，72℃ で 1 分 30 秒 ]
　　　　　　　を 30 回繰り返す。
　　　（3）　72℃ で 3 分の後，20℃ で保温。
　　　実習の時間が限られているので，片付けは藤原がやります。PCR 反応液は，次の
　　　実験の日まで冷蔵庫で保存しておきます。

5．　PCR 反応液を 10 μL，別のチューブに移し，6 x 色素溶液を 2 μL 加えて，
　　　全量を電気泳動する。
　　　注：　残りの PCR 産物は塩基配列決定用に使うので捨てずにとっておくこと。

6．　アガロースゲル電気泳動でバンドをチェックする。

Thermus aquaticus という好熱性細菌からとられた DNA 依存性 DNA ポリメラーゼ。PCR に
用いられる酵素の中で最もポピュラーであるが，proof-reading 機能が弱く，しばしば間違った
ヌクレオチドを取り込むことが知られている。また，合成した鎖の 3' 末端に，鋳型と無関係な
アデニンヌクレオチドを 1 個付加するクセがあり，これを利用して効率よくプラスミドに組み
込む手法も開発されている。詳しい情報については「知っておかなければならないこと」の中で
紹介した本を読むこと。今回の実習で使うのは宝酒造製。