PCR で使う DNA ポリメラーゼは,DNA を鋳型として相補的に DNA を合成する酵素である。したがって,抽出した RNA を
PCR の鋳型としてそのまま使うことはできない。そのため,RNA のもつ塩基配列情報を保ったままで,DNA に変換する。
この作業を「逆転写」とよぶ。逆転写は逆転写酵素による反応で,mRNA に相補的な DNA が合成される(これを complementary DNA
= cDNA とよぶ)。この実習で使う逆転写酵素は,Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (MMLV RTase)で,
元々は,ウイルスから見つかった逆転写酵素である。合成の開始には,プライマーとして鋳型に相補的に結合する短い核酸鎖
(オリゴヌクレオチド鎖)が必要である。実験ごとに RNA のどの位置から逆転写を始めさせるかを考え,プライマーの種類を選択する。
この実習では,dT17 と呼んでいたが,以下に示す 3 種類のオリゴヌクレオチドの混合物を使用した。
5'- TTTTTTTTTTTTTTTTTA -3' →(5'端 から dTTP が17個つながり,18 個目に dATP がつなっがている)
5'- TTTTTTTTTTTTTTTTTG -3' →(5'端 から dTTP が17個つながり,18 個目に dGTP がつなっがている)
5'- TTTTTTTTTTTTTTTTTC -3' →(5'端 から dTTP が17個つながり,18 個目に dCTP がつなっがている)
★ 結果 ★
・鋳型として total RNA を 何 ug 使いましたか? きちんと報告してください。
自分たちの班が RNA を 何 ug 使ってcDNAを合成したか?です。
逆転写がうまくいったかどうかの判定は,ほとんどの場合,合成した cDNA を次の実験に使ってみて,
その結果から判断する。
★ レポート作成のポイント
逆転写反応をどのような反応条件で行われたかを「方法」として記載しておくこと。
配布した資料とこのページにある情報を使ってまとめてください。
★ 課題2
この実習で上記のようなプライマーを使ったねらい(どんな反応が起こることを期待したのか?)を説明せよ。
また,上記に示したプライマー以外に,逆転写反応に使われるプライマーについて調べ,そのプライマーを使う目的
(どんな反応が起こることを期待して使うのか?)と合わせてまとめなさい。ちなみ,プライマーとしては,複数の
選択肢があります。
1) total RNA 抽出/RNA の品質チェック
3) RT-PCR
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