はじめに

ゲルから精製した DNA 断片（変異の入った EGFP cDNA 断片と、pQE30 プラスミド）を
連結して環状プラスミドを完成させます。どのようなプラスミドになるかは第 0 章（ こちら ）
を見て考えてください。

cDNA とプラスミドの連結に使うのは T4 ファージ由来の T4 DNA ligase という酵素です。
この酵素が触媒する反応は、末端の形状が同じ DNA どうしの塩基対形成ではありません。
DNA （または RNA）鎖の 5' リン酸基と、3' 水酸基を結合させる・・・すなわち、DNA の
ホスホジエステル結合を作る反応です（「分子遺伝学 C」の復習）。この実験では、
Promega という会社で売っている反応バッファーを使いますが、その組成が秘密になって
います。
　そこで、キットを使わない場合の基本的な方法を簡単に紹介します。 T4 DNA ligaseは、
例えば以下のような組成の反応液で使用します。
[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP]
MgCl₂ や DTT、ATP は必須です。通常の方法では室温または 14-16℃ 程度で 4‐16
時間ほど反応させます。T4 ファージが感染した大腸菌の細胞内では、酵素は 37℃ 付近
で働きます。実際 37℃ で反応させた方が速いのですが、酵素の熱安定性が低いので
早く失活してしまいます。そこで、低温で反応させるわけです。
　今回のように、2 種類の DNA 鎖を連結したい場合、DNA 鎖どうしが出会う確率が高い
ほど、ライゲーションの効率が高くなります。したがって、反応液にポリエチレングリコール
のような “場所をとる” ポリマー分子を高濃度で混ぜておくと、溶液の全容量の中で
DNA が動き回れる “スペースが非常に狭く” なり、ライゲーション効率が上がります。
キットでは、おそらくこのような工夫がなされており、そのため、室温程度でも非常に
効率よくライゲーションが起こります。
　今回のライゲーションでは、プラスミドを BamHI と HindIII で切断してあるので
プラスミド断片の両末端の形状が違います。したがって、“切れなかった” とか “片方の
酵素でしか切れなかった” というような “切れ残り” がない限り、1本のプラスミドの両端が
cDNA を挟まずに連結して閉じてしまうこと（セルフライゲーションという）はありません。
また cDNA どうしが結合することもありません。したがって、連結後に環状になったプラス
ミドは高率で cDNA を挟みこんでいることが期待されます。

1．　0.5 mL の PCR チューブに変異の入った EGFP cDNA と pQE30 を入れ
　　　合計 4 μL にする。
　　　注： ゲルから精製した DNA 断片を用意する。変異の入った cDNA を持った人と
　　　　　　pQE30 プラスミドを持った人が 1 人ずつペアになり、断片を交換して
　　　　　　ライゲーションの反応液を作る。このとき、各自の DNA 断片の、精製後の
　　　　　　電気泳動の結果を持ち寄り、cDNA とプラスミドのバンドの明るさがほぼ
　　　　　　等しくなるように量を決める（目安は、弱いけれどもはっきりとバンドが見える
　　　　　　程度）。その際、両方の断片の量の合計が 4 μL 以下になるようにする。
　　　　　　かすかにでもバンドが見えれば十分。多すぎるとうまく行かない。

2．　以下の試薬を加えて反応液を作る。

　　　　2x ライゲーションバッファー （Promega）　　　　 　5 μL
　　　　T4 DNA ligase （Promega） ^(a)　　　　　　　　　　　　　1 μL
　　　
3．　室温で 1 時間反応させる。

4．　第 1 章の「1 日め」（ こちら ）の方法で大腸菌のトランスフォーメーションを
　　　行う。
　　　注 1： ただし、RB791 ^(b) 系統の大腸菌の competent cells （50 μL）を使い、
　　　　　　クロラムフェニコールを含まない LB/amp 寒天培地にまく。
　　　注 2： ライゲーション反応液は 5 μL を使い、残りは冷蔵保存しておく。

5．　一晩培養し、翌日、プレートのコロニーを確認し、次のステップへ。

実験に使う試薬・器具

(a)　T4 DNA ligase

2 本鎖 DNA の付着末端あるいは平滑末端の 5' リン酸基と 3' 水酸基を連結する
酵素。二重鎖 DNA どうしだけではなく、二重鎖 DNA と二重鎖 RNA、あるいは
二重鎖 RNA の末端どうしを連結する活性もある。ただし 1 本鎖の核酸を連結する
ことはできない。

ここで使う大腸菌は、タンパク発現用のものが望ましい。CJ236 や DH5α は
使わない。CJ236 は、ウラシル DNA グリコシラーゼ等の遺伝子が欠損しており
DNA 損傷に対する修復の能力が弱い（ということは変異を起こしやすい）。また、
DH5α など通常のプラスミドのクローニングに使う大腸菌のもつ lac リプレッサー
（野生型の lacI 遺伝子産物）では、pQE30 などの発現ベクターの持つ強力な
プロモーター（pQE30 の場合には T5 ファージの初期プロモーター）を抑制すること
ができない。・・・「実験でタンパクを発現させたい」と考えるくらいだから、そのタンパク
は何か生物学上重要な機能を持っているはずで、そのような機能性タンパクを大量
発現させたら、大腸菌の生育に害を及ぼす可能性がある。したがって、（例えば
次の章のような）実験のときには、まず大腸菌をある程度増殖させておいて、
それからタンパクの発現を誘導するという手順をとる。そこで、増殖中の大腸菌で
常時タンパクが発現することのないように、しっかりと発現を抑制しなければならない。
RB791 のような大腸菌は、変異を起こして強力になったリプレッサーをコードする
lacI^q 遺伝子をもっており、pQE30 の強力なプロモーターを抑制できる。タンパク発現
用の大腸菌には、他にもさまざまな系統がある。中にはプロテアーゼの遺伝子を
欠損していて、外来タンパクを大量に発現させても内在性プロテアーゼによる分解を
受けないようになっている系統もある。